1.Définition et
appareillage. La chromatographie sur couche mince (CCM) repose
principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un
solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase
stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille
semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.
Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les
substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle
du solvant.
Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont :
– la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.
– la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 m de gel de silice
ou d’un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un
liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l’amidon ou
un polymère organique.
– l’échantillon : environ un microlitre (l) de solution diluée ( 2 à 5
%) du mélange à analyser, déposer en un point repère situé au-dessus de
la surface de l’éluant.
– l’éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long
de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon.
2.Principe de la technique. Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé
l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase
stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque
composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le
front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part, des forces
électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et,
d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se
déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase
mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant
principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption. Généralement,
en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.
3. Applications de la CCM. Lorsque les conditions opératoires sont
connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un
composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et
différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut
alors considérer que cet échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le
nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la
progression d’une réaction.
4. Adsorbants et plaques chromatographiques. Par ordre d’importance
décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice,
l’alumine,le kieselguhr et la cellulose.
Les plaques vous seront fournies prêtes à l’emploi.
5. Choix de l’éluant. L’éluant est formé d’un solvant unique ou d’un
mélange de solvants. Un éluant qui entraîne tous les composants de
l’échantillon est trop polaire ; celui qui empêche leur migration ne
l’est pas suffisamment.
Choix de l’éluant dans le cas d’analyses :
– d’hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
– de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole
mélangés en proportions variables avec du benzène ou de l’éther
diéthylique forment un éluant de polarité moyenne.
– de composés polaires : éthanoate d’éthyle, propanone ou méthanol.
6. Dépôt de l’échantillon. L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %)
dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément le même que l’éluant :
on emploie fréquemment le trichlorométhane (chloroforme), la propanone
ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un point de la plaque
situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt
soit faible ; idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont
généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures
séparations. Pour augmenter la quantité déposée, il est toujours
préférable d’effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant
rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule
fois un grand volume d’échantillon qui produirait une tache plus large.
L’échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube
capillaire en appuyant légèrement et brièvement l’extrémité de la
pipette sur la couche d’adsorbant en prenant soin de ne pas le
détériorer.
On vérifie l’identité des composants présumés d’un échantillon, en
procédant à un dépôt séparé d’une solution de chacun d’eux puis à celui
de leur mélange. Ces solutions témoins permettent de comparer la
migration de chaque composé avec celle de l’échantillon à analyser.
7. Développement de la plaque. Le développement consiste à faire migrer
le solvant sur la plaque. Dans les analyses usuelles de laboratoire, le
principal type de développement est la chromatographie ascendante : la
plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui
en recouvre le fond monte par capillarité.
Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve puis
on introduit la plaque. Pendant le développement du chromatogramme, la
cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée.
Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de
l’extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau
atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est
séchée à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir.
8. Révélation. Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont
colorés, leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans
le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un procédé de
révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes
usuelles de révélation sont les suivantes : radiations UV , fluorescence
, iode , atomisation.
Sauf indications contraires, nous utiliseront les radiations UV. En
exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés
apparaissent sous forme de taches brillantes.
Si un indicateur fluorescent est incorporé à l’adsorbant, la plaque
entière devient fluorescente lorsqu’elle est soumise à une radiation UV ;
les composés y sont révélés sous forme de taches sombres.
9. Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal).

di : distance parcourue par le composé (mesuré au centre de la tache)

ds : distance parcourue par le front du solvant
10. Description d’une analyse par CCM selon l’ordre chronologique.
Préparation de la cuve chromatographique.
– Introduire l’éluant ou le mélange de solvants.
– Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve.
– Garnir l’intérieur de la cuve d’un papier filtre imprégné d’éluant et
plaqué contre les parois ; une ouverture est ménagée dans le filtre pour
observer le développement du chromatogramme.
– Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant)
Dépôt de l’échantillon sur la plaque.
– Procéder au nettoyage de la plaque si nécessaire.
– Dissoudre l’échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 % .
– Déposer environ 0,5 ml de la solution en un point situé à 1 cm de
l’extrémité inférieure de la plaque; le diamètre de la tache doit être
d’environ 2 mm pour la disposition de plusieurs produits.
– Sécher à l’aide d’un séchoir ; éventuellement faire de nouvelles applications.
Développement du chromatogramme.
– Placer la plaque dans la cuve en position verticale.
– Refermer le récipient qui ne doit plus être déplacé.
– Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l’extrémité
supérieure de la plaque, la retirer et marquer cette position. (le trait
peut être tracé à l’avance et servir de repère pour arrêter l’élution).
Révélation et calcul de Rf.
– Sécher la plaque à l’aide d’un séchoir
– Révéler les taches sous une lampe U V
– Cercler les taches et pointer leur centre.
– Calculer les Rf
Chromatographie sur couche mince

Cette méthode très facile à mettre en œuvre est une des principales
utilisées dans les laboratoires. Elle présente l'avantage de ne
nécessiter que peu de matériel et donner des résultats facilement
interprétables mais pas toujours très reproductibles.

Mode opératoire
Le montage se compose d'une cuve et d'une plaque de
chromatographie, des composés à étudier et d'un éluant, un mélange
de solvant.
Choix du matériel
Dimensions de la plaque
Saturation de la cuve
Choix du support (silice, alumine, cellulose...)
Choix de l'éluant
Solvant polaire
Solvant apolaire
Proticité

Chromatographie

Préparation de la plaque
Elution et rétention comparée
Révélation
Révélation naturelle
Iode
UV
Acide sulfurique